เดงกีไวรัส (Dengue virus)

สุรภี อนันตปรีชา

บทนำ

         ไวรัสเดงกี เป็นเชื้อต้นเหตุก่อโรคไข้เลือดออกที่สำคัญในประเทศไทย เริ่มมีการระบาดครั้งแรกในปี พ.ศ. 2501 ในปัจจุบันนับได้ว่าโรคไข้เลือดออกเป็นโรคติดเชื้อ ที่นำโดยยุงลาย (Aedes aegypti ) ที่มีความสำคัญมาก โดยพิจารณาทางด้านสาธารณสุขที่มีผู้ป่วยในแต่ละปีเป็นจำนวนมาก และมีแนวโน้มเพิ่มมากขึ้นเรื่อยๆ สำหรับในปี 2545 มีรายงานผู้ป่วย 99,815 ราย คิดเป็นอัตราป่วยเท่ากับ 160.19 ต่อประชากรแสนคน มีรายงานผู้ป่วยเสียชีวิต 146 ราย คิดเป็นอัตราผู้ป่วยเสียชีวิตเท่ากับร้อยละ 0.23

         ไวรัสเดงกีเป็น single stranded RNA virus อยู่ใน Family Flaviviridae มี 4 serotypes คือ DEN1, DEN2, DEN3 และ DEN4 ซึ่งมี antigen ของกลุ่มบางชนิดร่วมกัน ทางทฤษฎีการติดเชื้อเดงกีจึงมีได้ถึง 4 ครั้ง เป็นที่ยอมรับกันว่าการติดเชื้อ serotype หนึ่งแล้ว จะสามารถป้องกันการติดเชื้อ serotype นั้นได้ตลอดชีวิต แต่ป้องกันการติดเชื้อ serotype อื่น ในช่วงระยะสั้นๆ ประมาณ 6-12 เดือน

         การติดเชื้อไวรัสเดงกี เริ่มจากคนถูกยุงที่มีเชื้อไวรัสกัด โดยเฉพาะยุงลาย Aedes aegypti  ซึ่งเป็นพาหะสำคัญ ระยะฟักตัวของโรคประมาณ 3-4 วัน (ส่วนใหญ่ประมาณ 2-7 วัน) คนส่วนใหญ่ติดเชื้อโดยไม่แสดงอาการ แต่ผู้ติดเชื้อส่วนหนึ่งจะแสดงอาการ ซึ่งจำแนกเป็นกลุ่มอาการของโรคดังนี้ คือ undifferentiated febrile illness, classical dengue fever, dengue hemorrhagic fever และ dengue shock syndrome ผู้ป่วยไข้เลือดออกเริ่มด้วยอาการไข้สูงเฉียบพลัน ช่วงเวลามีไข้นี้ กินเวลาประมาณ 2-10 วัน ซึ่งเป็นช่วงเวลาเดียวกับการพบไวรัสเดงกีในกระแสเลือด ที่เรียกว่า viremia ซึ่งเกิดก่อนมีไข้ประมาณ 24 ชั่วโมง ปริมาณไวรัสเดงกีในกระแสเลือด อาจอยู่ระดับต่ำหรือสูง ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์ (strain) ของไวรัส และความสามารถของระบบภูมิคุ้มกันที่ร่างกายสร้างขึ้นเพื่อกำจัดไวรัสนั้น viremia นั้นมักมีระดับสูงสุด เมื่อผู้ป่วยเริ่มมีอาการ และสามารถตรวจหาไวรัสในกระแสเลือดได้นานประมาณ 2-12 วัน

         การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันเกิดขึ้นพร้อมกับการลดลงของไวรัสในกระแสเลือด การติดเชื้อไวรัสเดงกีในแต่ละครั้ง จะมีรูปแบบของการตอบสนองของระบบแอนติบอดีต่างกัน ดังนี้

         1. Primary infection หรือการติดเชื้อครั้งแรก จะมีการสร้างแอนติบอดีที่จำเพาะต่อไวรัสอย่างช้าๆ และค่อนข้างจำเพาะต่อ serotype ที่ติดเชื้อครั้งแรกนั้น และมีการสร้างแอนติบอดีต่อเดงกีชนิด IgM มากกว่า IgG (มีสัดส่วนของ dengue IgM : IgG สูง) ในช่วงเวลาอย่างน้อย 3 สัปดาห์แรกของการติดเชื้อ

         2. Secondary infection เป็นการติดเชื้อเดงกีในผู้ที่เคยติดเชื้อไวรัสในกลุ่ม Flavivirus มาก่อน (อาจจะเป็นเดงกี,ไข้สมองอักเสบเจอี หรืออื่นๆ) การสร้างแอนติบอดีจึงเกิดขึ้นได้เร็ว และแอนติบอดีที่สร้างขึ้นจะไม่จำเพาะต่อ Dengue type ที่ติดเชื้อครั้งที่สองนั้น แต่จะมีอาการ cross reaction กับ dengue serotype อื่นๆ รวมถึงไวรัสที่อยู่ในกลุ่ม Flavivirus ชนิดอื่นด้วย และแอนติบอดีส่วนใหญ่จะเป็น IgG (สัดส่วน dengue IgM:IgG ต่ำ)

         การเกิด cross reaction ของแอนติบอดีนี้เองที่มีผลทำให้การแปลผลทาง Serology มีกฏเกณฑ์ที่ค่อนข้างยุ่งยาก

การตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ

         การตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ สำหรับโรคไข้เลือดออกเดงกี มีวัตถุประสงค์เพื่อยืนยันว่า การป่วยนั้นเกิดจากไวรัสเดงกีหรือไม่ และยังมีความสำคัญในแง่ของการเฝ้าระวังการระบาดของโรคไข้เลือดออกเดงกีด้วย (surveillance)

         การตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ สำหรับการติดเชื้อไวรัสเดงกี แบ่งได้เป็นกลุ่มดังต่อไปนี้

         1. การตรวจหาเชื้อเดงกีจากเลือดของผู้ป่วย ในระยะ viremia
         2. การตรวจหา RNA genome ของไวรัส โดยวิธี Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
         3. การตรวจหาแอนติบอดีจำเพาะต่อเดงกี


การเก็บตัวอย่างตรวจ

         เก็บตัวอย่างแรก (acute serum) ทันทีที่ผู้ป่วยเริ่มแสดงอาการหรือมาพบแพทย์ ซึ่งควรจะเป็นระยะที่มีไข้ ส่วน convalescent serum เก็บห่างจากวันเริ่มป่วย 10-14 วัน แต่ถ้าวันที่ผู้ป่วยกลับบ้านห่างจากวันเริ่มป่วยไม่ถึง 10 วัน ให้เก็บ serum ก่อนกลับบ้าน และถ้าเป็นไปได้ให้เก็บอีกครั้ง โดยห่างจากวันเริ่มป่วย 10-14 วัน

         ตัวอย่างที่ใช้ในการแยกเชื้อไวรัส หรือ ทำการตรวจโดยวิธี PCR คือ acute serum ซึ่งการเก็บ serum หรือการขนส่ง serum ควรใส่ไว้ในถัง liquid nitrogen และหลีกเลี่ยงการแช่แข็งแล้วละลายซีรั่มบ่อยๆ ซึ่งเป็นการทำลายไวรัส ทำให้โอกาสแยกเชื้อได้น้อยลง

         อาจใช้กระดาษซับเลือดสำหรับเก็บตัวอย่างเลือด เพื่อตรวจหาแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัส
เดงกีได้ถ้าจำเป็น แต่โดยทั่วไปแล้วควรจะใช้ serum มากกว่า ถ้าเก็บด้วยกระดาษซับเลือด ต้องใช้กระดาษซับเลือดมาตรฐานเท่านั้น ปัจจุบันที่ใช้กันคือ กระดาษซับเลือดที่มีลักษณะยาว Nobuto type I ผลิตโดยบริษัท Toyo Rashi Kaisha โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น

         การเก็บตัวอย่างเลือดต้องซับให้ชุ่ม ส่วนยาว (ข) ทั้งด้านหน้าและด้านหลัง
         นำหลอดที่ใส่ serum แช่ในกระติกน้ำแข็งทุกครั้งที่นำส่ง ให้ข้อมูลการเจาะเลือดและวันเริ่มป่วยทุกครั้งที่ส่งตัวอย่างตรวจ
         การเกิด hemolysis มีผลต่อการทดสอบ

การแยกเชื้อไวรัสเดงกี

         การแยกเชื้อไวรัสเดงกีจากตัวอย่างตรวจถือว่าเป็นการยืนยันสาเหตุ การเกิดโรคที่แน่นอนที่สุด นอกจากนั้นยังเป็นวิธีที่บอกถึง serotype ของไวรัสที่ก่อให้เกิดโรคหรือก่อให้เกิดการระบาด จึงมีความสำคัญในเเง่ระบาดวิทยา

         วิธีที่นิยมใช้ในปัจจุบันคือ Mosquito cell culture C6/C36 เป็นเซลล์เพาะเลี้ยงที่ถูกพัฒนาขึ้นมาใช้ในการแยกเชื้อไวรัสเดงกี หลังจากเลี้ยงไวรัส 7 วันเเล้ว ตรวจหาไวรัสโดยวิธี Fluorescence antibody techniques

Reverse transcription - Polymerase Chain reaction หรือ RT-PCR

         การทดสอบนี้เริ่มจากการสกัด RNA จากสิ่งส่งตรวจ เช่น ซีรั่ม จากนั้นเปลี่ยนสาย RNA genome ของไวรัสให้เป็น complementary DNA หรือ cDNA ในปฏิกิริยา reverse transcription หลังจากนั้นจึงทำ PCR เพื่อเพิ่มจำนวนสาย DNA โดยใช้ DNA region สั้นๆ ซึ่งอยู่ในสาย cDNA เป็น target และใช้ primer ที่จำเพาะต่อไวรัสเดงกีนั้นๆ

         การตรวจหา PCR product ทำได้หลายวิธี วิธีที่นิยม คือ นำ PCR product ไปทำ electrophoresis ใน agarose gel แล้วย้อม gel ด้วย ethidium bromide แล้วเทียบขนาดโมเลกุลของ PCR product กับขนาดของ product เมื่อ ใช้ไวรัสเดงกีเป็น control

         วิธี PCR เป็นวิธีที่รวดเร็ว อาจได้ผลภายใน 4 ถึง 24 ชั่วโมง มีความไว (sensitivity) และ ความจำเพาะ(specificity) สูง ข้อเสีย PCR คือ ค่าใช้จ่ายสูง และปัญหาเรื่องผล false positive เนื่องจากการปนเปื้อน (contamination) จาก amplicon (amplified PCR product ครั้งก่อน) ได้ง่าย ในการทดสอบจึงควรมี negative control ในขั้นตอนต่างๆของการทำ RT-PCR และผู้ปฏิบัติควรมีความชำนาญและระมัดระวังเป็นพิเศษ


การตรวจหาแอนติบอดีต่อเดงกี

1.Hemagglutination inhibition test (HI)

         เป็นวิธีมาตรฐาน หลักการคือ แอนติบอดีจำเพาะต่อไวรัสเดงกี ในตัวอย่างตรวจจะไปยับยั้งการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดงห่าน เมื่อผสมกับแอนติเจนที่เตรียมจากไวรัสเดงกีแต่ละ serotype ในการติดเชื้อครั้งแรก (primary infection) จะเริ่มตรวจพบ HI แอนติบอดีได้ประมาณ 5 วันหลังป่วย และสูงขึ้นอย่างช้าๆ ส่วนใหญ่ไตเตอร์จะไม่เกิน 640 ในการติดเชื้อครั้งแรกอาจบอก serotype ที่เป็นสาเหตุของโรคได้ ส่วนการติดเชื้อซ้ำ (secondary infection) HI แอนติบอดีจะสูงขึ้นอย่างรวดเร็วภายใน 2-3 วันแรกที่ป่วย ไตเตอร์มากกว่าหรือเท่ากับ 2560 และเป็นแอนติบอดีที่ cross reactive กับ flavivirus อื่นด้วย

         การแปลผล HI ตามเกณฑ์ขององค์การอนามัยโลก สรุปไว้ในตารางที่ 1

ตารางที่ 1 การแปลผลการทดสอบวิธี HI สำหรับการติดเชื้อไวรัสเดงกี

Antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay (Antibody capture ELISA)

        เป็นการตรวจหาแอนติบอดีชนิด IgM และ IgG เชิงปริมาณที่จำเพาะต่อไวรัสเดงกี ในน้ำเหลืองของผู้ป่วย สามารถบอกได้ว่าผู้ป่วยติดเชื้อแบบ Primary infection หรือ Secondary infection

        โดยทั่วไปจะตรวจพบ dengue IgM ได้ประมาณ 2 วัน หลังจากไข้ลดแล้ว อาจจะตรวจพบได้นานถึง 90 วัน แต่ส่วนใหญ่จะลดลงถึงระดับที่ตรวจไม่พบ ภายใน 60 วัน

        ผู้ป่วยด้วย Primary infection จะตรวจพบ dengue IgM antibody สูง และ IgG ต่ำ ในขณะที่ผู้ป่วยติดเชื้อซ้ำ (Secondary infection) Dengue IgG antibody จะสูงเมื่อเปรียบเทียบกับ IgM

การแปลผลสรุปไว้ในตารางที่ 2

ตารางที่ 2 การแปลผลการทดสอบวิธี Antibody capture ELISA สำหรับการติดเชื้อไวรัสเดงกี

หมายเหตุ รายที่ตรวจหาเชื้อด้วยวิธี Virus isolation และ/หรือ PCR และให้ผลบวกจะใช้ Acute นำหน้าในการแปลผลเสมอ

      มีผู้ผลิต test kit สำหรับตรวจแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสเดงกี หลายบริษัท ในประเทศไทยมีผู้ใช้บ้าง ได้แก่

      ข้อควรระวังในการใช้ Rapid test เหมือนกับวิธีหา IgM ทั่วไป คือ ถ้าทำการทดสอบเพียงครั้งเดียว ในขณะที่ผู้ป่วยยังมีอาการอยู่อาจให้ผลลบได้ เนื่องจากระดับ IgM ยังขึ้นไม่สูงพอ อีกประการคือ ความจำเพาะของ test ยังไม่ดีนัก เนื่องจากอาจให้ผลบวกได้เช่นกัน ในผู้ป่วยที่ติดเชื้อ Flavivirus อื่น เช่นไวรัสสมองอักเสบเจอี

      โดยสรุปวิธีที่มักใช้ในการยืนยันการติดเชื้อเดงกี ได้แก่วิธี MAC-ELISA , GAC-ELISA และวิธี HI ส่วนการแยก เชื้อจะทำจาก acute serum ซึ่งเจาะขณะผู้ป่วยยังมีไข้อยู่ เซลล์ที่นิยมใช้ได้แก่ C6/36 การแยกเชื้อหรือการทำ PCR สามารถบอกserotype ของไวรัสได้ ดังนั้นจึงมีความสำคัญในแง่การศึกษาการเปลี่ยนแปลงของการระบาดของไวรัสเดงกีแต่ละ serotype

      วิธี capture ELISA และ HI สามารถบอกได้ว่าผู้ป่วยติดเชื้อแบบ primary infection หรือ secondary infection แต่ไม่สามารถบอก serotype ของเชื้อเดงกีที่ติดได้ ส่วนการแยกเชื้อ และ การทำ PCR ไม่สามารถบอกได้ว่าผู้ป่วยติดเชื้อแบบ primary infection หรือ secondary infection แต่บอก serotype ของไวรัสเดงกีที่เป็นสาเหตุได้

เอกสารอ้างอิง